Chemismus der Dipeptidylpeptidase 4

Das Enzym Dipeptidylpeptidase 4 (kurz DPP 4, DP IV oder DPP IV) wurde erstmals 1964/66 von Hopsu-Havu und Glenner beschrieben.[1] Die Autoren bezeichneten das neu gefundene Enzym als Dipeptid-Naphthylamidase. Einige Zeit später wurde das Enzym durch Schulz und Barth unabhängig von Hopsu-Havu und Glenner wiederentdeckt. Entscheidend war zur Enzymreinigung die Ionenaustauscherchromatographie mit Sephadex DEAE A-50.[2][3][4] Im Ergebnis verschiedener Untersuchungen zum Chemismus wurde das Enzym als Dipeptidyl-Peptidase IV [DP IV] bezeichnet. Im Rahmen weiterer Untersuchungen wurde erstmals festgestellt, dass es sich um eine Serinprotease handelt. Erst im Laufe der Zeit wurde erkannt, dass dieses Enzym wesentliche Funktionen im menschlichen und tierischen Organismus ausübt.

Nach der Nahrungsaufnahme werden im Magen verschiedene Hormone freigesetzt, sogenannte Inkretine, die die Freisetzung von Insulin im Körper steigern. Die DPP 4 spaltet diese Inkretine und stoppt somit deren Wirkung. Daraus folgt, dass Inhibitoren der DPP 4 potentielle Medikamente gegen Diabetes mellitus Typ II sind, da eine vermehrte Freisetzung von Insulin helfen kann, den chronisch erhöhten Blutzucker zu senken. Als Ergebnis der Erforschung der Dipeptidylpeptidase-4 und deren Inhibitoren sind bereits zwei Arzneistoffe, Sitagliptin und Vildagliptin, durch den Ausschuss für Humanarzneimittel (CHMP) der Europäischen Arzneimittelagentur als Therapeutika zur Behandlung des Diabetes mellitus Typ 2 zugelassen worden.[5]

Gegen Diabetes mellitus Typ I würde eine Hemmung dieses Enzyms nichts bewirken: Hier kann überhaupt kein Insulin mehr produziert werden, da die Inselzellen der Bauchspeicheldrüse vollkommen zerstört sind.

Der Funktionsmechanismus aus chemischer Sicht (Chemismus)

Das Enzym DPP 4 kommt ubiquitär im menschlichen, aber auch im tierischen Organismus vor. Es ist eine Proteinase, die vom N-terminalen Ende eines Peptids Zweiergruppen von Aminosäuren (Dipeptide) abspaltet. Da sich im Aktiven Zentrum des Enzyms die Aminosäure Serin befindet, gehört es zu den Serinproteinasen. Es kann nur vom Aminogruppen-Ende (N-Terminus) eines Peptids Dipeptide abspalten, nicht jedoch vom Carboxygruppen-Ende, dem C-Terminus (siehe Peptidbindung).

Ein beispielhaftes Peptid als Substrat für die DPP 4 sieht folgendermaßen aus, wobei Xaa2, Xaa1 und X'aa1 für beliebige Aminosäuren stehen und der senkrechte Strich für die Stelle, an der das Enzym die Peptidbindung spaltet. Mit P2, P1 und P'1 werden die Positionen der Aminosäuren relativ zur Spaltungsstelle beschrieben:

N-Xaa2-Xaa1-|-X'aa1-…
P2 P1 P'1

N-Xaa2-Xaa1-C + N-X'aa1-…

Die DPP 4 spaltet bevorzugt Peptide, wenn sich ein Prolinrest (Pro) in P1-Position befindet.[6]

Die Substratspezifität in P1-Position (Xaa1)

Neben Peptiden mit Prolin in P1-Stellung, spaltet die DPP 4 auch noch Peptide mit anderen Aminosäuren in dieser Position.[7][8]

Zunächst wurde festgestellt, dass neben Prolin- auch Hydroxyprolin- und Dehydroprolinreste sehr gut akzeptiert werden. Auch Substrate mit Pipecolinsäureresten (Pip) in P1-Stellung sind ähnlich aktiv. Im Schema 1 wird ein „Prolinstammbaum“ vorgestellt[9] der auf direktem Wege vom Prolin bis zum Glycin führt. Versuchsweise wurden die einzelnen Di-Peptid-para-Nitroanilide (pNA) in P1-Stellung gegen die angeführten Aminoacylreste des „Stammbaums“ ausgetauscht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass alle diese Derivate mehr oder weniger aktive Substrate darstellen. Erfolgreich geprüft wurden in Ala-Xaa1-pNA besonders Xaa1 = Thz, Oxa, Pipecolinsäure (Pip) und Azetidin-2-carbonsäure (Aze).

Schema 1: Prolinstammbaum (In dem Schema ist auch das Sechsringsystem der Pipecolinsäure enthalten, sie liefert auch aktive Substrate).

Ferner wurden geprüft die Xaa1-Reste von: Glycin (Gly), 2-Aminobutansäure (Abu), Norvalin (Nva), Sarcosin (Sar), N-Ethyl-Glycin, N-(n-Propyl)-Glycin, N-Methyl-2-Aminobutansäure, N-Methyl-Alanin und N-Ethyl-Alanin. Interessant ist, dass es im Hinblick auf die Wirksamkeit der DPP 4 Substrate eine Abstufung in folgender Richtung gibt:

Prolin > Alanin > Glycin

Hinsichtlich des kcat/KM-Wertes ist das Aze-Derivat vergleichbar mit dem entsprechenden Pro-Substrat. In dem einen Fall handelt es sich um einen Fünf- im anderen Fall um einen Vierring. Ebenfalls interessant war die Prüfung der Verbindungen Ala-Xaa1-pNA mit Xaa1 = a-5MeOxa, und s-5MeOxa. Ala-(s-5MeOxa)-pNA fungierte als Substrat, Ala-(a-5MeOxa)-pNA nicht [s = syn, a = anti]. Der Prolinring ist nicht planar gebaut, sondern liegt in einer Konfiguration analog dem Schema 2 (links) vor.

Schema 2: „γ-Puckering“[10] der fünfgliedrigen Ringe am Beispiel des Thz; Oxa = Ersatz von S durch O, Pro = Ersatz von S durch >CH₂ (links). Stellung der Hydroxygruppe im Hyp-System {Ala-Hyp-pNA [Ala-trans-Hyp-pNA oder Ala-anti-Hyp-pNA; Ala-cis-Hyp-pNA oder Ala-syn-Hyp-pNA] (rechts)}

Demzufolge sind auch die Positionen im Ringsystem des Prolins unterschiedlich zu bewerten. Daraus erklärt sich, warum Xaa2-Hyp-pNA ein Substrat ist, Xaa2-(a-5MeOxa)-pNA aber mittels DPP 4 nicht enzymatisch hydrolysiert wird.

Es wird beobachtet, dass in Substraten vom Typ Xaa2-Pro-X’aa1 die Spaltungsrate von der Natur des Restes X’aa1 abhängt. Offensichtlich verschiebt sich in diesem Falle der geschwindigkeitsbestimmende Schritt (siehe unten) von der Deacylierung (k3) in vorangehende Schritte. Denkbar ist eine Behinderung des Einstroms dieser Substrate in das aktive Zentrum der DPP 4. Der langsamste Schritt sollte hier möglicherweise vor dem eigentlichen katalytischen Prozess liegen. Hier ist im einfachsten Fall (bei Annahme von ka sehr viel kleiner als k3 und k3 sehr viel kleiner als k2 und k1)[11]

kcat = k3ka und M = k-ak3/kak1

ka = Geschwindigkeitskonstante des Einstroms des Substrates in das aktive Zentrum, k-a = Geschwindigkeitskonstante des Ausstroms des Substrates aus dem aktiven Zentrum, k1 = Geschwindigkeitskonstante tetraedrischen Intermediats, k2 = Geschwindigkeitskonstante des Acylierungsschrittes (TI1 ® Acylenzym), k3 = Geschwindigkeitskonstante des Deacylierungsschrittes (TI2 ® Dipeptid).

Die Substratspezifität in P2-Position (Xaa2)

Auch wurde die Bedeutung des N-terminalen Aminosäurerestes in P2-Stellung (Xaa2) eruiert. Untersucht wurden u. a. in Xaa2-Pro-pNA die Reste von: Pro, Abu, Leu, Val, Ala, Ile, Glu, Phe, Tyr, Ser, Gln, Lys, Asp, Asn sowie N,N-Dimethyl-Glycin [(N,N)-DMG], N,N,N-Trimethyl-Glycin [(N,N,N)-TMG] und S,S-Dimethyl-sulfonium-essigsäure [(S,S)-DMS]. Alle Substanzen fungierten als Substrate der DPP 4 (siehe Tabelle 1).

Tabelle 1
X-Pro-p-nitroanilid X =	k_cat in s⁻¹	K_m in 10⁵ M
Pro	51,5 ± 0,3	0,92 ± 0,03
α-Aba	72,7 ± 0,7	1,53 ± 0,05
Leu	65,4 ± 0,6	44,9 ± 0,9
Val	1,75 ± 0,04	1,28 ± 0,08
Ala	54,6 ± 0,4	1,66 ± 0,05
Ile	28,5 ± 4,9	39,5 ± 0,3
Glu	1,23 ± 0,67	2,10 ± 0,07
Phe	71,3 ± 1,7	4,27 ± 0,25
Tyr	62,9 ± 2,2	4,03 ± 0,34
Ser	61,0 ± 0,8	3,99 ± 0.24
Gln	69,8 ±4,7	4,90 ± 0.98
Lys	54,8 ± 1,2	5,16 ± 0,25
Gly	78,4 ± 0,7	10,2 ± 0,52
Asp	30,1 ± 0,3	5,85 ± 0,22
Asn	51,4 ± 1,0	11,8 ± 0,83
Sar	97,3 ± 0,02	13,0 ± 0,12
(N,N)-DMG	0,9 ± 0,02	145 ± 10
(N,N,N)-TMG	1,5 ± 0,2	7040 ± 1200
(S,S)-DMS	0,3 ± 0,02	1135 ± 80

Wie weit entfernt kann die N-terminale Aminofunktion von der Peptidbindung zwischen P1 und P2 sein? Dazu wurden in Xaa2-Pro-pNA Aminosäurereste von Ala, β-Ala, γ-Abu und ε-Ahx verwendet. Die Derivate von Ala, β-Ala und γ-Abu sind Substrate der DPP 4 mit fallender Tendenz. Die ε-Ahx-Verbindung wird nicht hydrolysiert.[12]

Tabelle 2
X-Pro-p-nitroanilid X =	k_cat in s⁻¹	K_m · 10⁵ in M
Ala	54,6 ± 0,4	1,66 ± 0,05
β-Ala	6,7 ± 0,1	154 ± 8,5
γ-Abu	0,9 ± 0,03	352 ± 30
ε-Ahx	keine hydrolytische Aktivität

Die Rolle der Aminoacylreste in P’1-Position (X’aa1)

Um die Bedeutung der Aminoacylreste in P’1-Position zu klären, wurden kinetische Studien mit den Tripeptiden Ala-Pro-X’aa1 durchgeführt. Überraschenderweise zeigt sich, dass keine enzymatische Hydrolyse stattfindet, wenn X’aa1 = Pro-, Hyp-, Dehydroprolyl-, Pipecolyl-, Aciridyl-Reste sind oder allgemein die zu spaltende Peptidbindung –CO–NH– durch –CO–N(R)– ersetzt ist (R ungleich H).

Die „Erkennungsstruktur“ der Substrate der DPP 4

Auf Grund des umfangreichen kinetischen Datenmaterials wurden intensive Studien der Computersimulation durchgeführt. Ein Resultat dieser Bemühungen war die Formulierung einer Struktur, die alle Substrate besitzen müssen, um im aktiven Zentrum der DPP 4 als Substrate erkannt zu werden. Diese „Erkennungsstruktur“ ist in der Abbildung 1 gezeigt.

Abb. 1

Von Bedeutung ist die interne H-Brücke. Jede Behinderung ihrer Ausbildung führt zur Inaktivität als Substrat,.[13] Die Tatsache, dass jede Substitution an der NH-Gruppe der zu spaltenden Peptidbindung diese verhindert, ist der Grund, warum alle Peptide die das Strukturmerkmal –CO–N(R)– mit R ungleich H haben einer enzymatischen Hydrolyse nicht zugänglich sind. Es ist zu erwarten, dass die interne H-Brücke verhindert wird durch:

eine cis-Peptidbindung und
den optischen Antipoden

Es ist bekannt, dass Prolinpeptide über eine messbare cis-Konfiguration an der zu spaltenden Peptidbindung verfügen. Wir haben das Verhältnis von trans- zu cis-Bindung am Beispiel des Substrates Ala-Pro-pNA ermittelt und die enzymatische Hydrolyse mit Hilfe der schnellen Kinetik („Stopped-Flow-Methode“) verfolgt. Es zeigt sich ein biphasischer Umsatz nach der Zeit. In der ersten Phase kann ein schneller von der Enzymkonzentration abhängiger Abbau bis zu dem Prozentsatz, der für das Vorhandensein der trans-Peptidbindung gefunden wurde, beobachtet werden, danach erfolgt ein langsamer Reaktionsverlauf, der bestimmt wird, von der Enzym-unabhängigen cis-trans-Umwandlungsgeschwindigkeit. Demnach erfolgt erwartungsgemäß eine Spaltung nur über die trans-Bindung, die cis-Bindung ist inaktiv.

Die Stereospezifität

Ferner sind die Substrate in P1-Position absolut stereospezifisch. Ala-L-Pro-pNA z. B. ist ein gutes Substrat, Ala-D-Pro-pNA wird enzymatisch nicht hydrolysiert. Bei Verbindungen vom Typ D-Xaa2-Pro-pNA findet ebenfalls keine Hydrolyse statt. D-Xaa2-Ala-pNA aber sind Substrate der DPP 4. Tabelle 3 demonstriert dies am Beispiel des Ala-Ala-pNA, D-Ala-Ala.pNA und Aib-Ala-pNA. Das Phänomen, dass D<-Phe-Pro-pNA und D-Tyr-Pro-pNA unkompetitive Inhibitoren der Hydrolyse von Ala-Pro-pNA sind (die Ki-Werte sind: 0,35 ± 0,04 mM und 0,52 ± 0,04 mM), wonach beide Inhibitoren keine kompetitive oder gemischte Hemmer sind, und bei Ala-Ala-pNA als Substrat die Verbindungen keinen inhibitorischen Effekt zeigen, ist im Zusammenhang mit den in dieser Arbeit diskutierten theoretischen Schlussfolgerungen zu sehen.

Tabelle 3: stereospezifische Effekte
Verhältnis	in $K_{M}$	in $k_{cat}$	in $k_{cat}/K_{M}$
$[a]/[c]$	0,92 ± 0,13	18,27 ± 1,81	19,95 ± 0,91
$[a]/[b]$	0,86 ± 0,15	40,39 ± 4,28	47,33 ± 2,47
$[c]/[b]$	0,95 ± 0,20	2,23 ± 0,34	2,38 ± 0,15
$[a]$ = Ala-Ala-pNitroanalinid, $[b]$ = D-Ala-Ala-pNitroanalinid, $[c]$ = Aib-Ala-pNitroanalinid

Auffallend ist, dass die Stereoselektivität in P2, wie die Tabelle 3 zeigt, sich nicht auf den K_M-Wert, wohl aber gravierend auf die k_cat-Werte aufwirkt. Auf diesen Effekt, der überraschend ist, soll weiter unten eingegangen werden.

Die Sequenz der Enzymkatalyse

Es wird angenommen, dass im Verlaufe der Enzymkatalyse die Reaktionsfolge, dargestellt in Schena 3, durchlaufen wird:

Schema 3

Danach ist zwischen einem Acylierungsprozess und einem Deacylierungsprozess zu unterscheiden. Das Substrat dringt in das aktive Zentrum ein (siehe Erkennungskomplex) und es bildet sich ES. Daraus folgt das tetraedrische Intermediat des Acylierungsprozesses TI₁. Nach Abspaltung des ersten Spaltproduktes entsteht durch Anlagerung eines Wassermoleküls das zweite tetraedrische Intermediat TI₂ (Deacylierungsprozess). Nach Spaltung von diesen wird letztendlich das freie Enzym und das zweite Spaltprodukt (Dipeptid) freigesetzt. Das erste tetraedrische Intermediat TI₁ ist asymmetrisch. Theoretisch kann sich hier eine S- und/oder eine R-Form ausbilden. TI₂ ist dagegen symmetrisch. Hier entstehen keine antipodischen Strukturen.

Zunächst erhebt sich die Frage, wo bei den Substraten der geschwindigkeitsbestimmende Schritt lokalisiert ist, ob im Bereich der Acylierung oder der Deacylierung. Es wurden daher Untersuchungen mit den Substraten Ala-Ala-anilid und Ala-Pro-Anilid mit verschieden substituierten Arylringen im pH-Optimum durchgeführt. Der Hansch-Approach (QSWA = Quantitative-Struktur-Wirkungs-Analyse) brachte keine Korrelation bei den substituierten Derivaten der Reihe Ala-Pro-Anilid, wohl aber eine solche in der Reihe Ala-Ala-Anilid.

Substrat : Ala-Ala-NH-C₆H₄-R
QSWA : lgkcat = 0,807s ± 0,186
R : -H, p-F, p-Cl, p-Br, p-CH3, p-OCH₃, p-OC₂H₅, p-NO₂, m-Cl, m-CH₃, m-CF₃, m-NO₂

Substrat : Ala-Pro-NH-C6H4-R
QSWA : keine Korrelation

Daraus geht hervor, dass der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Alaninreihe in der Acylierung liegt, in einem Bereich also, wo die substituierten Aniline noch nicht abgespalten sind (k2). In der Prolinreihe dagegen sollte der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der Deacylierung liegen (k3). Die Messungen wurden beim pH-Optimum (siehe unten) durchgeführt.

Die Frage ist nun: lässt sich die Konformation des tetraedrischen Intermediats TI₁ ermitteln? Zu diesem Zwecke wurde eine QCAR Analyse (Quantitative Conformation Activity Relationships) in der Alaninreihe durchgeführt. Die Resultate lassen vermuten, dass die Effekte dann auftreten, wenn der –NH-Ar-Rest aus dem tetraedrischen Intermediat TI₁ austritt (k2). Aus der QCAR-Analyse folgt nämlich eine mögliche Konformation mit einer „Behinderung“ der Wasserstoffatome a und b, die, entsprechend der Struktur in Schema 4 bei der Rotation des aromatischen Ringes auftritt.

Schema 4

Das Schema 5 demonstriert die beiden Antipoden des TI₁. Nur die Form links führt zur sterischen Hinderung der oben genannten Wasserstoffatome, nicht aber die rechts dargestellte Struktur. Dies könnte ein Hinweis auf die Stereospezifität des tetraedrischen Intermediates TI1 sein (im Zusammenhang mit den Ergebnissen der D-Isotopemessungen – siehe unten).

Die Untersuchungen zur pH-Wert Abhängigkeit, demonstriert an der DPP 4 aus Schweinenierenrinde, ergab ein pH-Optimum von ca. 6,7. Das Temperaturoptimum liegt bei etwa 30 °C. Die Studien ergaben ferner, dass für die Aktivität der Substrate eine positive Ladung am N-Terminus nötig ist. Dabei ist die Protonierung der N-terminalen primären Aminogruppe notwendig. Sie ist aber keine Bedingung. Für die Substraterkennung ist die Existenz einer positiven Ladung genügend, wie aus der Tabelle 1 hervorgeht. Streng genommen handelt es sich bei der DPP 4 also nicht um eine Aminopeptidase, sondern um eine Oniumacylaminoacyl-Peptidase. Die katalytische Abspaltung von Dipeptiden aus einem Oligo- oder Polypeptid vom N-terminalen Ende ist aber, physiologisch gesehen, ein essentieller Prozess.

Schema 5

Sekundäre D-Isotopieeffekte und Solventisotopieeffekte in D₂O

Im Schema 4 und Schema 5 (links) ist ein mögliches Modell des TI1 dargestellt. Seine Bestätigung sollte durch D-Isotopieeffekte möglich sein, wenn einerseits ein H/D-Austausch im Asymmetriezentrum der P1 Aminosäure erfolgt und andererseits ein H/D-Austausch im aromatischen Ring in o-Stellung erfolgt. Es zeigt sich, dass in beiden Fällen sekundäre D-Isotopieeffekte zu messen sind.

Bei Ala-Ala-pNA (L-Ala-L-Ala-d1-pNA) sind im pH-Optimum bei Zimmertemperatur sekundäre D-Isotopieeffekte messbar. Sie betragen in k_cat = 1,27 und in K_M = 1,24. Wird das Substrat im aromatischen Ring vollständig deuteriert (Ala-Ala-NH-C₆D₄-pNO₂), so ergeben sich sekundäre D-Isotopieeffekte in k_cat und in K_M von 1,05 ± 0,03.

Interessant ist, dass ein sekundärer D-Isotopieeffekt in k_cat/K_M, entsprechend dem Schema 6 in Abhängigkeit vom pH-Wert auftritt. Der Kurvenverlauf ist bemerkenswert. Bei fallenden pH-Werten von etwa 7,5 bis etwa 5,0 ist kein Isotopieeffekt messbar. Ab pH 5,0 beobachtet man einen steigenden sekundären D-Isotopieeffekt mit fallendem pH-Wert, verbunden mit einem Übergang von k₃ nach k₂ als geschwindigkeitsbestimmenden Schritt.

Schema 6

Dieses Resultat unterstreicht die hohe Wahrscheinlichkeit der in dem Schema 4 dargestellten Struktur.

Messungen der Solvent-D-Isotopieeffekt ergeben im Falle der Substrate Ala-Pro-pNA und Gly-Pro-pNA mit dem in der Deacylierung liegenden geschwindigkeitsbestimmenden Schritt einen Ein-Protonen-Übergang und beim Ala-Ala-pNA, der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der Acylierung liegend, einen Zwei-Protonen-Übergang (Tabelle 4).

Tabelle 4: Zwei-Protonen-Übergang
Substrat	pH	beste Anpassung an die Funktion $k_{n}=k_{0}+c_{1}n+c_{2}n^{2}+\ldots +c_{i}n^{i}$ (signifikant entsprechend F-Test)	Parameter	Protonenübergänge
Ala-Pro-pNA	7,5	$k_{n}=6{,}81(\pm 0{,}02)+(-3{,}78)n$ $k_{n}=4{,}84(\pm 0{,}07)+(-2{,}47)n$	k_cat k_cat/K_M	1 1
Gly-Pro-pNA	6,8	$k_{n}=1{,}59(\pm 0{,}03)+(-1{,}02)n$ $k_{n}=4{,}86(\pm 0{,}06)+(-3{,}15)n$	k_cat k_cat/K_M	1 1
Ala-Ala-pNA	7,5	$k_{n}=7{,}21(\pm 0{,}01)+(4{,}54)n+(-8{,}28)n^{2}$ $k_{n}=1{,}27(\pm 0{,}01)+(-0{,}91)n+(0{,}32)n^{2}$	k_cat k_cat/K_M	(2) 2

Inhibitoren

Es wurden eine Reihe von Dipeptiden auf ihre Wirkung als (kompetitive) Inhibitoren der DPP 4 untersucht. Die Tabelle 5 zeigt eine Übersicht.

Tabelle 5: Dipeptide
Dipeptide	K_i in M
Gly-Pro	(1,6 ± 0,2) · 10⁻³
Val-Pro	(1,0 ± 0,1) · 10⁻⁵
Leu-Pro	(7,0 ± 0,7) · 10⁻⁵
Ile-Pro	(6,9 ± 0,3) · 10⁻⁶
Asp-Pro	(2,0 ± 1,5) · 10⁻⁴
Arg-Pro	(4,2 ± 1,0) · 10⁻⁵
Phe-Pro	(4,7 ± 1,5) · 10⁻⁵
ε-Z(4-NO₂)Lys-Pro	(1,1 ± 0,2) · 10⁻⁶
β-Ala-Pro	(1,7 ± 0,1) · 10⁻²
Ala-Ala	(4,1 ± 0,7) · 10⁻⁴
Ile-Ala	(1,0 ± 0,1) · 10⁻⁵
Ala-D-Ala	(1,8 ± 0,2) · 10⁻³
Pro-Gly	(9,0 ± 0,4) · 10⁻³
Gly-Phe	(3,2 ± 0,5) · 10⁻³
Ile-Val	(4,0 ± 0,1) · 10⁻⁵
ε-Z(4-NO₂)Lys-D-Pro	(4,4 ± 0,3) · 10⁻⁵
ε-Z(4-NO₂)Lys-Pip	(2,2 ± 0,1) · 10⁻⁵
ε-Z(4-NO₂)Lys-D-Pip	(2,0 ± 0,1) · 10⁻⁴
ε-N-CapronylLys-Pro	(4,8 ± 0,1) · 10⁻⁵
ε-N-PalmitylLys-Pro	(8,1 ± 0,1) · 10⁻⁵

Von diesen Dipeptiden, die auch Spaltprodukte DPP 4-Katalyse sind, ist das Ile-Pro mit einem K_i-Wert von etwa 7,0 · 10⁻⁶ M und das ε-Z(4-NO₂)Lys-Pro (K_i etwa 10⁻⁶) interessant. Um etwa eine Größenordnung wirksamer sind die entsprechenden Pyrrolidide (Tabelle 6).

Tabelle 6: Pyrrolidide
X-Pyrrolidid X =	pH	K_i in M
Ile	6,3	(3,3 ± 0,6) · 10⁻⁷
Ile	7,6	(1,9 ± 0,4) · 10⁻⁷
Phe	6,3	(2,5 ± 0,7) · 10⁻⁶
Phe	7,6	(2,3 ± 0,2) · 10⁻⁶
ε-Z(4-NO₂)Lys	6,3	(3,9 ± 0,5) · 10⁻⁷

Röntgenkristallstruktur der Dipeptidylpeptidase 4

Gegenwärtig sind intensive Studien auf dem Gebiet der Röntgenkristallstrukturanalyse der DPP 4 im Gange. Das Enzym besteht in der Regel aus zwei identischen Untereinheiten. Jede dieser Untereinheiten besitzt eine N-terminale Peptidsequenz, die das Protein an der Oberfläche einer Zelle verankert. Es wurden auch höhere Aggregate bei der löslichen DPP 4 gefunden, bestehend aus vier identischen Untereinheiten.

Für bestimmte Aussagen ist eine nicht so in das Detail gehende Darstellung der Conolli-Oberfläche günstiger. Hier zeigt sich, dass die DPP 4 eine ungewöhnliche Oberflächenstruktur besitzt. Das aktive Zentrum befindet sich nicht an der Oberfläche außen, sondern in Innern des Proteins. Der Zugang zu dem aktiven Zentrum ist durch einen „Schlauch“ möglich, der eine größere und eine kleinere Öffnung besitzt. Die Frage ist, wie und vor allem wo erfolgt z. B. der Substrateintritt?

Wenn man sich das elektrostatische Potential an der Oberfläche ansieht, so stellt man fest, dass in der Nähe und innerhalb der großen Öffnung ein sehr starkes negatives Potential mit einem Gradienten in Richtung der Öffnung vorhanden ist (Abbildung 3). Die kleinere Öffnung hat demgegenüber kein so starkes negatives Potential. Es ist daher denkbar, dass die Substrate mit dem positiv geladenen N-Terminus der das Potential größerer Bereiche der Erkennungsstruktur der Substrate prägt in diese Öffnung „hineingezogen“ werden. (Darstellung einer Untereinheit, humane DPP 4).

Abb. 3

Die Struktur des tetraedrischen Intermediats TI1

Aus dem experimentellen Befund, wonach das als Substrat fungierende D-Ala-Ala-pNA über kcat wirkt, wobei KM gegenüber dem des Substrates Ala-Ala-pNA unbeeinflusst bleibt (siehe Tabelle 3), drängt sich die Deutung auf, dass der N-terminale Aminoacylrest (wahrscheinlich mit der positiven Ladung) direkt mit dem tetraedrischen Intermediat in P1-Position in Wechselwirkung tritt. Daher wurde eine hypothetische Konformation wie folgt konstruiert (Schema 7).

Schema 7

Es scheint zwei Typen von Wasserstoffbrücken zu geben, nämlich solchen, die für die direkte Bindung im aktiven Zentrum verantwortlich sind, d. h., das Substrat oder den Inhibitor an die wechselwirkungsaktiven Reste des Proteins heranführen und solchen, die direkter Bestandteil des Funktionsmechanismus sind. Wenn im Laufe des Funktionsmechanismus der Serinproteasen tetraedrische Intermediate TI1 und TI2 (siehe Schema 3) entstehen, ist TI1 asymmetrisch. Beim Aufrichten des Carbonylatoms der zu spaltenden Peptidbindung können sich zwei antipodische Konformationen ausbilden, von der eine das Peptid als Substrat (1), die andere als Inhibitor (2) erkennen sollte (Schema 5).

Die Entscheidung, in welcher Richtung sich die Carbonylgruppe aufrichtet, d. h., welches der antipodischen tetraedrischen Intermediate bevorzugt entsteht, wird davon abhängen, in welcher Richtung die Wechselwirkungen der Proteinseitenketten im aktiven Zentrum (z. B. H-Brücken) am wirkungsvollsten sind bzw. die räumliche Anpassung des Effektormoleküls am effektivsten erfolgt. So ist es durchaus möglich, dass ein Inhibitormolekül auch Substrat sein kann. Eine entscheidende Triebkraft der Abtrennung eines Molekülteils aus dem tetraedrischen Intermediat ist, ob das Prinzip der stereoelektronischen Kontrolle nach Delongchamps[14] gültig ist. Es besagt, dass die Spaltung von Estern oder Amiden über ein tetraedrisches Intermediat nur erfolgen kann, wenn beide am zentralen sp3-Kohlenstoffatom verbleibende Heteroatome eines ihrer einsamen Elektronenpaare jeweils antiperiplanar zur spaltenden Bindung ausrichten.

Die Röntgenstrukturanalyse des DPP 4/Pro-Pro-boronsäurekomplexes[15] bestätigt in eindrucksvoller Weise die im Schema 7 angenommene Struktur (Abbildung 4). Außerdem geht aus dem hypothetischen Schema 7 eindeutig hervor, warum die DPP 4 keine N-terminalen Aminosäuren entfernen kann,sondern nur N-terminale Dipeptide abspaltet. Von Interesse ist, dass der Boronsäurekomplex tatsächlich eine tetraedrische Struktur ausbildet, dass eine Wechselwirkung einerseits mit dem Tyr547 des Proteins und einem O-Atom des TI (Abstand = 2,04 A) stattfindet und dass andererseits zwischen dem Asn710 des Proteins und dem Sauerstoffatom der Carbonylgruppe der N-terminalen Peptidbindung eine Wechselwirkung erfolgt (Abstand = 1,93 A). Letztere H-Brücke ist sinnvoll. Sie fördert die Aufrichtung der Carbonylgruppe der N-terminalen Peptidbindung im oben gezeigten Sinne (vergl. Schema 7). Diese Verhältnisse sind in dem Ausschnitt aus der Röntgenkristallstruktur des DPP 4/Boronsäure-Komplexes (Abbildung 4) ersichtlich.

Abb. 4[15]

Ähnliche Bilder zeigen die durch Diprotin A (Abbildung 5 – rechts) und tertBuGly-Pro-Ile (Abbildung 5 – links) erzeugten Strukturen. Hier entstehen asymmetrische tetraedrische Konformationen. Sie stellen sich als antipodisch gegenüber der in dem Schema 7 angenommenen Struktur dar. Sollten diese durch die Röntgenstruktur ermittelten realen antipodischen Strukturen charakteristisch für Transition-State-Inhibitoren sein? Durch diese hypothetische Annahme ließe sich erklären, warum die Verbindungen

Diprotin A (Ile-Pro-Ile)
Diprotin B (Val-Pro-Leu) und
TertBuGly-Pro-Ile,

die grundsätzlich eine Substratstruktur besitzen, Inhibitoren sind. Der Begriff „hypothetisch“ bringt zum Ausdruck, dass die hier gezeigten Röntgenstrukturen (Abbildung 5) die Konformationen von Inhibitoren darstellen, die Konformationen der TI (TI1) von Substraten können unter den experimentellen Bedingungen der Röntgenkristallstrukturanalyse nicht dargestellt werden.

Abb. 5: tBu-GPI Ligand (links) und IPI Ligand (rechts)

Die Frage: Sind Diprotin A oder Diprotin B Substrate oder Inhibitoren der DPP 4? – wurde im Jahre 1991 von Rahfeld et al. gestellt. Umezawa et al.[16] berichten, dass beide Diprotine als Inhibitoren der DPP 4 wirken. Rahfeld stelle fest, dass sowohl Ile-Pro-Ile als auch Val-Pro-Leu erwartungsgemäß Substrate der DPP 4 sind. Die Autoren sprechen von der Inhibitorwirkung als einem „kinetischen Artefakt“ Die Röntgenkristallstruktur-Studien belegen die Konformation in TI1, die dem Inhibitormolekül zugeordnet werden sollte, denn die Substratstruktur ist mit Sicherheit unter den Kristallisationsbedingungen nicht erfassbar. Umso erstaunlicher ist, dass die Diprotine im wässriger Milieu (kinetische Messungen) nach längerer Zeit (nach ca. 20,5 Stunden unter den in der Literatur angegebenen Bedingungen) vollständig hydrolysiert werden. Offensichtlich stellt sich ein Gleichgewicht der antipodischen TI-Konformationen in verdünnter wässriger Lösung allmählich immer wieder neu ein. Über einen solchen Mechanismus wird der Dualismus bei den Diprotinen klar. Ihre K_i- und K_M-Werte sind in der Tabelle 7 gezeigt.

Tabelle 7: K_i- und K_M-Werte von Diprotinen
Parameter	Val-Pro-Leu	Ile-Pro-Ile
k_cat in s⁻¹	27,00 ± 0,05	1,29 ± 0,02
K_M in M	(1,63 ± 0,10) · 10⁻⁵	(3,50 ± 0,30) · 10⁻⁶
k_cat/K_M in M⁻¹·s⁻¹	(1,66 ± 0,10) · 10⁶	(3,69 ± 0,30) · 10⁵
K_i in M	(1,88 ± 0,40) · 10⁻⁵	(1,28 ± 0,36) · 10⁻⁶

Natürliche Substrate der Dipeptidylpeptidase 4

(siehe Dipeptidylpeptidase 4)

Abschließende Bemerkungen

Die Dipeptidylpeptidase 4 ist physiologisch und pharmakologisch von großem Interesse. Einige aktive und spezifische Inhibitoren des Enzyms wurden als potentielle Wirkstoffe gegen Diabetes mellitus Typ II erkannt.[17] Mittlerweile sind die beiden Dipeptidylpeptidase-4-Inhibitoren Sitagliptin und Vildagliptin als Arzneistoffe zur Therapie des Diabetes mellitus Typ 2 zugelassen. Es gibt Hinweise, dass DPP 4 oder verwandte Enzyme eine Rolle bei Prozessen der Wundheilung, möglicherweise in einer Reihe von Krebsarten (Dipeptidyl Peptidase IV und Aminopeptidase N scheinen nach englischsprachigen Veröffentlichungen auch bei der Ausbildung von Thyreoidalcarcinomen involviert zu sein) und in der Pathogenese von AIDS spielen.

Schon vor einigen Jahren wurde die enge Verwandtschaft der Enzyme DP II und PSE (Prolin spezifische Endopeptidase), auch PPCE (Post Proline Cleaving Enzyme) genannt, zur DPP 4 beschrieben. In neuerer Zeit wurde gefunden, dass die DPP 4 Mitglied einer Familie von Dipeptidyl-Peptidasen ist. Es ist zu vermuten, dass auf diesem Gebiet durch vergleichende mechanistische und physiologische Studien noch weitere Einsichten in theoretische und angewandte Fragestellungen resultieren werden.

Einzelnachweise

Hopsu-Havu VK, Glenner GG: A new dipeptide naphthylamidase hydrolyzing glycyl-prolyl-beta-naphthylamide. In: Histochemie. 7, Nr. 3, 1966, S. 197–201. PMID 5959122.
Horst Schulz, „Beiträge zur Reinigung und Charakterisierung einer Dipeptidylaminopeptidase aus Schweinenieren“ Dissertation an der Universität Halle, eingereicht Ende 1972, verteidigt im März 1973
Alfred Barth, Horst Schulz, Pharmazie 29, 195, 1974
Alfred Barth, Horst Schulz, Klaus Neubert, Acta biol. med. germ. 37, 157, 1974
Drucker DJ: Therapeutic potential of dipeptidyl peptidase IV inhibitors for the treatment of type 2 diabetes. In: Expert Opin Investig Drugs. 12, Nr. 1, Januar 2003, S. 87–100. doi:10.1517/13543784.12.1.87. PMID 12517256.
Eintrag in der Enzyme Nomenclature des NC-IUBMB
Heins J, Welker P, Schönlein C, et al.: Mechanism of proline-specific proteinases: (I) Substrate specificity of dipeptidyl peptidase IV from pig kidney and proline-specific endopeptidase from Flavobacterium meningosepticum. In: Biochim. Biophys. Acta. 954, Nr. 2, Mai 1988, S. 161–9. PMID 2896517.
Rahfeld J, Schutkowski M, Faust J, Neubert K, Barth A, Heins J: Extended investigation of the substrate specificity of dipeptidyl peptidase IV from pig kidney. In: Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 372, Nr. 5, Mai 1991, S. 313–8. PMID 1678608.
Barth,A.:Vier Jahrzehnte im Dienste der Wissenschaft. In:"Acta Facult.Pharm.Univ.Comenianae",52,236-250,2005
Schutkowski, M.: Dissertation an der Universität Halle
vergl. Küllerts, G., Fischer, G., Barth, A.: Beiträge zum Katalysemechanismus der Dipeptidyl Peptidase IV "Acta biol. med. germ.", 37, 559-567, 1978
Küllertz, G., Oehme, P., Barth, A.(Hrsg.): Dipeptidyl Peptidase IV – Chemie, Biochemie und physiologische Aspekte, Beitr Wirkst.Forsch., 1981. Auch als: Küllertz, G., Oehme, P., Barth, A. In: Pharmazie, 36, Nr.7, 518 ff, 1981
Brandt, W., Lehmann, T., Hofmann, T., Schowen, RL., Barth, A.: The probable conformation of substrates recognized by dipeptidyl-peptidase IV and some aspects of the catalytic mechanism derived from theoretical investigations, "J. Comput. Aided Mol. Des.", 6, No.2, 159–174, 1992
P.Delongchamps,Stereoelectronic control in the cleavage of tetrahedral intermediates in the hydrolyses of esters and amides,"Tetrahedron" 31,2463-2490,1975
Engel M, Hoffmann T, Manhart S, et al.: Rigidity and flexibility of dipeptidyl peptidase IV: crystal structures of and docking experiments with DPIV. In: J. Mol. Biol.. 355, Nr. 4, Januar 2006, S. 768–83. doi:10.1016/j.jmb.2005.11.014. PMID 16330047.
H. Umezawa, T. Aoyagi, K. Ogawa, H. Naganawa, M. Hamada: Diprotins A and B, inhibitors of dipeptidyl aminopeptidase IV, produced by bacteria. In: The Journal of Antibiotics. Band 37, Nr. 4, April 1984, S. 422–425, doi:10.7164/antibiotics.37.422, PMID 6427168.
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Literatur

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A. Barth, I. Thondorf, J. Stano: Gedanken zum Mechanismus der Serinproteasen,Teil I – Die Funktion der Tetrade: Asp….His….Ser….Xaa. In: Acta Facult. Pharm. Univ. Comenianae 51, 15–26 (2004).
A. Barth, I. Thondorf, S. Gebauer, W. Brandt, K. Neubert, J. Stano, M. Psenak, P.Kovacs: Gedanken zum Mechanismus der Serinproteasen, Teil II–Dipeptidyl-Peptidase IV (DP IV/CD 26). In: Acta Facult. Pharm. Univ. Comenianae 52, 7–21 (2005).
A. Barth, I. Thondorf, S. Gebauer, K. Neubert, P. Kovacs, J. Stano: Gedanken zum Mechanismus der Serinproteasen, Teil III – a) Das tetraedrische Intermediat im Acylierungsprozess. b) Die Boronsäuren. In: Acta Facult. Pharm. Univ. Comemianae 53, 5–15 (2006)
A. Barth, I. Thondorf, K. Neubert, S. Hoffmann, P. Kovacs, J. Stano: Gedanken zum Mechanismus der Serinproteasen, Teil IV – Transition State Inhibitoren – Das asymmetrische tetraedrische Intermediat TI 1. In: Acta Facult. Pharm. Univ. Comenianae 53, 16–21 (2006).
A. Barth, I. Thondorf: "Gedanken zum Mechanismus der Serinproteasen, Teil V - Dipeptidyl Peptidase IV -Biochemisch-physiolögische Aspekte" In: "Acta Facult." Pharm. Univ. Comenianae 54, 7 - 13 (2007).
A. Barth, I. Thondorf, P. Kovacs: "Gedanken zum Mechanismus der Serinproteasen, Teil VI - DP IV Inhibitoren. Wirkstoffe gegen Diabetes Typ II mit neuartigem Wirkmechanismus" In: "Acta Facult." Pharm. Univ. Comenianae 55, 5 - 10 (2008)
A. Barth: "Gedanken zum Mechanismus der Serinproteasen, Teil VII - Ein Überblick [1966 - 2006]" In: "Acta Facult." Pharm. Univ. Comenianae 55, 11 - 22 (2008)
S. Ansorge (Hrsg.): Abstracts of the 2nd International Conference on Dipeptidyl Aminopeptidases – Basic Sciences and Clinical Applications. Magdeburg, Germany 2005.
U. Langdeckel, D. Reinhold, U. Bank (Hrsg.): Dipeptidyl Aminopeptidases – Basic Science and Clinical Applications (Proceedings) in Advances in Experimental Medicine and Biology. Vol. 575, Springer 2006.
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M. Engel, T. Hofmann, S. Manhart, U. Heiser, S. Chambre, R: Huber, H.-U. Demuth, W. Bode: Rigitity and Flexibility of Dipeptidyl Peptidase IV: Crystal Structures of and Docking Experiments with DP IV. In: J. Mol. Biol. 355 768–783 (2006).
R. Thoma, B. Löffler, M. Stihle, M. Huber, W. Ruff, A. und M. Hennig: Structural basis of proline-specific exopeptidase activity as observed in Human dipeptidyl peptidase-IV. In: Structure (Camb). 11, 947–959 (2003).
J. Rahfeld, M. Schierhorn, B. Hartrodt, K. Neubert, J. Heins: Are diprotin A (Ile-Pro-Ile) and diprotin B (Val-Pro-Leu) inhibitors or substrates of dipeptidyl peptidase IV? In: Biochim. Biophys. Acta. 1976, 314–316 (1991).
H. Umezawa, T. Aoyagi, H. Naganawa, M. Hamada T. Takeuchi: Diprotins A and B, Inhibitors of Dipeptidyl Aminopeptidase IV, Produced by Bacteria. In: J. Antibiotics. 37, 422–425 (1984).

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[1] Hopsu-Havu VK, Glenner GG: A new dipeptide naphthylamidase hydrolyzing glycyl-prolyl-beta-naphthylamide. In: Histochemie. 7, Nr. 3, 1966, S. 197–201. PMID 5959122.

[2] Horst Schulz, „Beiträge zur Reinigung und Charakterisierung einer Dipeptidylaminopeptidase aus Schweinenieren“ Dissertation an der Universität Halle, eingereicht Ende 1972, verteidigt im März 1973

[3] Alfred Barth, Horst Schulz, Pharmazie 29, 195, 1974

[4] Alfred Barth, Horst Schulz, Klaus Neubert, Acta biol. med. germ. 37, 157, 1974

[5] Drucker DJ: Therapeutic potential of dipeptidyl peptidase IV inhibitors for the treatment of type 2 diabetes. In: Expert Opin Investig Drugs. 12, Nr. 1, Januar 2003, S. 87–100. doi:10.1517/13543784.12.1.87. PMID 12517256.

[6] Eintrag in der Enzyme Nomenclature des NC-IUBMB

[7] Heins J, Welker P, Schönlein C, et al.: Mechanism of proline-specific proteinases: (I) Substrate specificity of dipeptidyl peptidase IV from pig kidney and proline-specific endopeptidase from Flavobacterium meningosepticum. In: Biochim. Biophys. Acta. 954, Nr. 2, Mai 1988, S. 161–9. PMID 2896517.

[8] Rahfeld J, Schutkowski M, Faust J, Neubert K, Barth A, Heins J: Extended investigation of the substrate specificity of dipeptidyl peptidase IV from pig kidney. In: Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 372, Nr. 5, Mai 1991, S. 313–8. PMID 1678608.

[9] Barth,A.:Vier Jahrzehnte im Dienste der Wissenschaft. In:"Acta Facult.Pharm.Univ.Comenianae",52,236-250,2005

[10] Schutkowski, M.: Dissertation an der Universität Halle

[11] vergl. Küllerts, G., Fischer, G., Barth, A.: Beiträge zum Katalysemechanismus der Dipeptidyl Peptidase IV "Acta biol. med. germ.", 37, 559-567, 1978

[12] Küllertz, G., Oehme, P., Barth, A.(Hrsg.): Dipeptidyl Peptidase IV – Chemie, Biochemie und physiologische Aspekte, Beitr Wirkst.Forsch., 1981. Auch als: Küllertz, G., Oehme, P., Barth, A. In: Pharmazie, 36, Nr.7, 518 ff, 1981

[13] Brandt, W., Lehmann, T., Hofmann, T., Schowen, RL., Barth, A.: The probable conformation of substrates recognized by dipeptidyl-peptidase IV and some aspects of the catalytic mechanism derived from theoretical investigations, "J. Comput. Aided Mol. Des.", 6, No.2, 159–174, 1992

[14] P.Delongchamps,Stereoelectronic control in the cleavage of tetrahedral intermediates in the hydrolyses of esters and amides,"Tetrahedron" 31,2463-2490,1975

[DPIV-Kristallstruktur-15] Engel M, Hoffmann T, Manhart S, et al.: Rigidity and flexibility of dipeptidyl peptidase IV: crystal structures of and docking experiments with DPIV. In: J. Mol. Biol.. 355, Nr. 4, Januar 2006, S. 768–83. doi:10.1016/j.jmb.2005.11.014. PMID 16330047.

[16] H. Umezawa, T. Aoyagi, K. Ogawa, H. Naganawa, M. Hamada: Diprotins A and B, inhibitors of dipeptidyl aminopeptidase IV, produced by bacteria. In: The Journal of Antibiotics. Band 37, Nr. 4, April 1984, S. 422–425, doi:10.7164/antibiotics.37.422, PMID 6427168.

[17] Barth A.,Thondorf I.,Kovacs P. "Acta Facult.Pharm.Univ.Comenianae",55,5,2008