Zinkfingernukleasen

Zinkfingernukleasen (ZFN) sind künstlich hergestellte Restriktionsenzyme. Sie enthalten eine Zinkfingerdomäne, die an DNA bindet, und eine Nukleasedomäne, welche die DNA schneidet.[1] Die Zinkfingerdomäne kann so gebaut werden, dass sie eine bestimmte DNA-Sequenz erkennt. Das bedeutet, dass man mit ZFN ein komplexes Genom an einer ganz bestimmten Stelle schneiden kann und so einen zielgerichteten Einbau von fremder DNA ermöglicht.

Nukleasedomäne

Zinkfingernukleasen enthalten i​n der Regel d​ie unspezifisch schneidende Nukleasedomäne d​es Typ-IIS-Restriktionsenzyms FokI[2]. Diese Restriktionsdomäne i​st nur aktiv, w​enn sie dimerisiert vorliegt[3], weswegen z​wei unterschiedlich gebaute ZFN-Monomere benötigt werden, u​m die DNA-Zielsequenz z​u schneiden. Bei Standard-ZFN i​st die Restriktionsdomäne über i​hr N-terminales Ende a​n die DNA-bindende Zinkfingerdomäne gebunden. Damit d​ie Nukleasedomänen dimerisieren u​nd schneiden können, müssen d​ie beiden unterschiedlichen ZFN-Monomere a​n die beiden unterschiedlichen Stränge d​er DNA binden, w​obei ihre C-Termini e​inen bestimmten Abstand zueinander h​aben müssen.[4]

Mehrere verschiedene Protein-Engineering-Techniken werden eingesetzt, u​m einerseits d​ie Enzymaktivität u​nd andererseits Affinität u​nd Spezifität d​er Zinkfingerdomäne z​u steigern. So w​urde beispielsweise „Gerichtete Evolution“ angewandt, u​m FokI-Varianten z​u erzeugen, d​ie eine erhöhte Nukleaseaktivität aufweisen.[5] Zudem w​urde strukturelles Design eingesetzt, u​m mittels Austausch geladener Aminosäuren i​m Dimerisierungsinterface d​er Nukleasedomäne sogenannte "obligat-heterodimere" FokI-Varianten z​u erzeugen, d​ie eine deutlich erhöhte Restriktionsspezifität aufweisen.[6][7][8][9]

DNA-Bindedomäne

Die DNA-Bindedomäne enthält typischerweise zwischen drei und sechs unterschiedliche Zinkfingermotive, wobei jedes individuelle Zinkfingermotiv 3 bp erkennt. Binden die Zinkfingerdomänen perfekt an ihre Erkennungssequenz, so reichen drei Zinkfinger pro ZFN-Monomer aus, um einen bestimmten Lokus in einem komplexen Genom spezifisch zu erkennen. Mehrere verschiedene Strategien wurden entwickelt, um Cys2His2-Zinkfinger herzustellen, die an gewünschte Sequenzen binden.[10] Diese Methoden umfassen sowohl das modulare Zusammenbauen (siehe unten) als auch Selektionsstrategien, wie das Phagendisplay, das Yeast-1-Hybrid-Systeme, das Bacterial one-hybrid System, das Bacterial two-hybrid System oder zelluläre Selektionssysteme.

Die einfachste Methode, n​eue Zinkfingerarrays z​u erzeugen, i​st die Kombination v​on Zinkfingern m​it bekannter Spezifität. Der a​m weitesten verbreitete modulare Zusammenbauprozess i​st das Kombinieren v​on drei unterschiedlichen Zinkfingern, d​ie jeweils 3 b​p erkennen, z​u einem n​euen Zinkfingerarray, d​er 9 b​p erkennt. Der Hauptnachteil dieser Methode ist, d​ass sich d​ie Spezifität e​ines Zinkfingers j​e nach benachbartem Zinkfinger i​m Array verändern kann, weshalb "kontextabhängige" Selektionsstrategien üblicherweise Zinkfingerarrays m​it einer höheren Spezifität erzeugen.[11]

Anwendungen

Zinkfingernukleasen sind nützlich, um die Genome vieler Pflanzen- und Tierarten zielgerichtet zu verändern, einschließlich der Genome von Arabidopsis[12][13], Tabak[14][15], Soja[16], Mais[17], Fruchtfliege[18], Fadenwurm[19], Platynereis dumerilii[20], Seeigel[21], Seidenraupe[22], Zebrafisch[23], Frosch[24], Maus[25], Ratte[26], Kaninchen[27], Schwein[28], Rind[29] und verschiedener Typen von Säugerzellen[30]. Darüber hinaus wurden ZFN in vivo in einem Mausmodell für Hämophilie angewandt[31], und eine klinische Studie hat ergeben, dass autologe CD4-positive T-Zellen mit durch Zinkfingernukleasen ausgeschaltetem CCR5-Gen sicher sind, um als Behandlung für HIV/AIDS dienen zu können[32]. Alternativ zu Zinkfingernukleasen können Transcription Activator-like Effector Nucleases und die CRISPR/Cas-Methode verwendet werden.

Einzelnachweise
  1. T. Cathomen, J. K. Joung: Zinc-finger nucleases: the next generation emerges. In: Mol. Ther.. 16, Nr. 7, Juli 2008, S. 1200–7. doi:10.1038/mt.2008.114. PMID 18545224.
  2. Y. G. Kim, J. Cha, S. Chandrasegaran: Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. In: Proc Natl Acad Sci USA. 93, Nr. 3, 1996, S. 1156–60. doi:10.1073/pnas.93.3.1156. PMID 8577732. PMC 40048 (freier Volltext).
  3. J. Bitinaite, D. A. Wah, A. K. Aggarwal, I. Schildkraut: FokI dimerization is required for DNA cleavage. In: Proc Natl Acad Sci USA. 95, Nr. 18, 1998, S. 10570–5. doi:10.1073/pnas.95.18.10570. PMID 9724744. PMC 27935 (freier Volltext).
  4. Eva-Maria Händel, Stephen Alwin, Toni Cathomen: Expanding or Restricting the Target Site Repertoire of Zinc-finger Nucleases: The Inter-domain Linker as a Major Determinant of Target Site Selectivity. In: Molecular Therapy. 17, 2008, S. 104–111, doi:10.1038/mt.2008.233.
  5. doi:10.1016/j.jmb.2010.04.060
  6. DOI:10.1038/nbt1317
  7. Jeffrey C Miller, Michael C Holmes u. a.: An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. In: Nature Biotechnology. 25, 2007, S. 778–785, doi:10.1038/nbt1319.
  8. Yannick Doyon, Thuy D Vo u. a.: Enhancing zinc-finger-nuclease activity with improved obligate heterodimeric architectures. In: Nature Methods. 8, 2010, S. 74–79, doi:10.1038/nmeth.1539.
  9. DOI:10.1016/j.jmb.2010.10.043
  10. C. O. Pabo, E. Peisach, R. A. Grant: Design and Selection of Novel Cys2His2 Zinc Finger Proteins. In: Annu. Rev. Biochem.. 70, 2001, S. 313–340. doi:10.1146/annurev.biochem.70.1.313. PMID 11395410.
  11. Cherie L Ramirez, Jonathan E Foley u. a.: Unexpected failure rates for modular assembly of engineered zinc fingers. In: Nature Methods. 5, 2008, S. 374–375, doi:10.1038/nmeth0508-374.
  12. F. Zhang, M. L. Maeder, E. Unger-Wallace, J. P. Hoshaw, D. Reyon, M. Christian, X. Li, C. J. Pierick, D. Dobbs, T. Peterson, J. K. Joung, D. F. Voytas: High frequency targeted mutagenesis in Arabidopsis thaliana using zinc finger nucleases. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, Nr. 26, 2010, S. 12028–12033. doi:10.1073/pnas.0914991107.
  13. K. Osakabe, Y. Osakabe, S. Toki: Site-directed mutagenesis in Arabidopsis using custom-designed zinc finger nucleases. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, Nr. 26, 2010, S. 12034–12039. doi:10.1073/pnas.1000234107.
  14. C. Q. Cai, Y. Doyon, W. M. Ainley, J. C. Miller, R. C. Dekelver, E. A. Moehle, J. M. Rock, Y. L. Lee, R. Garrison, L. Schulenberg, R. Blue, A. Worden, L. Baker, F. Faraji, L. Zhang, M. C. Holmes, E. J. Rebar, T. N. Collingwood, B. Rubin-Wilson, P. D. Gregory, F. D. Urnov, J. F. Petolino: Targeted transgene integration in plant cells using designed zinc finger nucleases. In: Plant Molecular Biology. 69, Nr. 6, 2008, ISSN 0167-4412, S. 699–709. doi:10.1007/s11103-008-9449-7. PMID 19112554.
  15. J. A. Townsend, D. A. Wright, R. J. Winfrey, F. Fu, M. L. Maeder, J. K. Joung, D. F. Voytas: High-frequency modification of plant genes using engineered zinc-finger nucleases. In: Nature. 459, Nr. 7245, 2009, S. 442–445. bibcode:2009Natur.459..442T. doi:10.1038/nature07845. PMID 19404258. PMC 2743854 (freier Volltext).
  16. S. J. Curtin, F. Zhang, J. D. Sander, W. J. Haun, C. Starker, N. J. Baltes, D. Reyon, E. J. Dahlborg, M. J. Goodwin, A. P. Coffman, D. Dobbs, J. K. Joung, D. F. Voytas, R. M. Stupar: Targeted Mutagenesis of Duplicated Genes in Soybean with Zinc-Finger Nucleases. In: Plant Physiology. 156, Nr. 2, 2011, S. 466–473. doi:10.1104/pp.111.172981. PMID 21464476. PMC 3177250 (freier Volltext).
  17. V.K. Shukla, Y. Doyon, J.C. Miller: Precise genome modification in the crop species Zea mays using zinc-finger nucleases. In: Nature. 459, Nr. 7245, Mai 2009, S. 437–41. bibcode:2009Natur.459..437S. doi:10.1038/nature07992. PMID 19404259.
  18. M. Bibikova, K. Beumer, J. Trautman, D. Carroll: Enhancing Gene Targeting with Designed Zinc Finger Nucleases. In: Science. 300, Nr. 5620, 2003, S. 764. doi:10.1126/science.1079512. PMID 12730594.
  19. A. J. Wood, T. -W. Lo, B. Zeitler, C. S. Pickle, E. J. Ralston, A. H. Lee, R. Amora, J. C. Miller, E. Leung, X. Meng, L. Zhang, E. J. Rebar, P. D. Gregory, F. D. Urnov, B. J. Meyer: Targeted Genome Editing Across Species Using ZFNs and TALENs. In: Science. 333, Nr. 6040, 2011, S. 307. doi:10.1126/science.1207773. PMID 21700836. PMC 3489282 (freier Volltext).
  20. Martin Gühmann, Huiyong Jia, Nadine Randel, Csaba Verasztó, Luis A. Bezares-Calderón, Nico K. Michiels, Shozo Yokoyama, Gáspár Jékely: Spectral Tuning of Phototaxis by a Go-Opsin in the Rhabdomeric Eyes of Platynereis. In: Current Biology. 25, Nr. 17, August 2015, S. 2265–2271. doi:10.1016/j.cub.2015.07.017.
  21. H. Ochiai, K. Fujita, K. I. Suzuki, M. Nishikawa, T. Shibata, N. Sakamoto, T. Yamamoto: Targeted mutagenesis in the sea urchin embryo using zinc-finger nucleases. In: Genes to Cells. 15, Nr. 8, 2010, S. no. doi:10.1111/j.1365-2443.2010.01425.x. PMID 20604805.
  22. Y. Takasu, I. Kobayashi, K. Beumer, K. Uchino, H. Sezutsu, S. Sajwan, D. Carroll, T. Tamura, M. Zurovec: Targeted mutagenesis in the silkworm Bombyx mori using zinc finger nuclease mRNA injection. In: Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40, Nr. 10, 2010, S. 759–765. doi:10.1016/j.ibmb.2010.07.012. PMID 20692340.
  23. S.C. Ekker: Zinc Finger–Based Knockout Punches for Zebrafish Genes. In: Zebrafish. 5, Nr. 2, 2008, S. 1121–3. doi:10.1089/zeb.2008.9988. PMID 18554175. PMC 2849655 (freier Volltext).
  24. J. J. Young, J. M. Cherone, Y. Doyon, I. Ankoudinova, F. M. Faraji, A. H. Lee, C. Ngo, D. Y. Guschin, D. E. Paschon, J. C. Miller, L. Zhang, E. J. Rebar, P. D. Gregory, F. D. Urnov, R. M. Harland, B. Zeitler: Efficient targeted gene disruption in the soma and germ line of the frog Xenopus tropicalis using engineered zinc-finger nucleases. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, Nr. 17, 2011, S. 7052–7057. doi:10.1073/pnas.1102030108.
  25. A. D. Goldberg, L. A. Banaszynski, K. M. Noh, P. W. Lewis, S. J. Elsaesser, S. Stadler, S. Dewell, M. Law, X. Guo, X. Li, D. Wen, A. Chapgier, R. C. Dekelver, J. C. Miller, Y. L. Lee, E. A. Boydston, M. C. Holmes, P. D. Gregory, J. M. Greally, S. Rafii, C. Yang, P. J. Scambler, D. Garrick, R. J. Gibbons, D. R. Higgs, I. M. Cristea, F. D. Urnov, D. Zheng, C. D. Allis: Distinct Factors Control Histone Variant H3.3 Localization at Specific Genomic Regions. In: Cell. 140, Nr. 5, 2010, S. 678–691. doi:10.1016/j.cell.2010.01.003. PMID 20211137. PMC 2885838 (freier Volltext).
  26. A. M. Geurts, G. J. Cost, Y. Freyvert, B. Zeitler, J. C. Miller, V. M. Choi, S. S. Jenkins, A. Wood, X. Cui, X. Meng, A. Vincent, S. Lam, M. Michalkiewicz, R. Schilling, J. Foeckler, S. Kalloway, H. Weiler, S. Menoret, I. Anegon, G. D. Davis, L. Zhang, E. J. Rebar, P. D. Gregory, F. D. Urnov, H. J. Jacob, R. Buelow: Knockout Rats via Embryo Microinjection of Zinc-Finger Nucleases. In: Science. 325, Nr. 5939, 2009, S. 433–433. doi:10.1126/science.1172447. PMID 19628861. PMC 2831805 (freier Volltext).
  27. T. Flisikowska, I. S. Thorey, S. Offner, F. Ros, V. Lifke, B. Zeitler, O. Rottmann, A. Vincent, L. Zhang, S. Jenkins, H. Niersbach, A. J. Kind, P. D. Gregory, A. E. Schnieke, J. Platzer: Efficient Immunoglobulin Gene Disruption and Targeted Replacement in Rabbit Using Zinc Finger Nucleases. In: PLoS ONE. 6, Nr. 6, 2011, S. e21045. doi:10.1371/journal.pone.0021045. PMID 21695153. PMC 3113902 (freier Volltext).
  28. J. Hauschild, B. Petersen, Y. Santiago, A. -L. Queisser, J. W. Carnwath, A. Lucas-Hahn, L. Zhang, X. Meng, P. D. Gregory, R. Schwinzer, G. J. Cost, H. Niemann: Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, Nr. 29, 2011, S. 12013. doi:10.1073/pnas.1106422108.
  29. S. Yu, J. Luo, Z. Song, F. Ding, Y. Dai, N. Li: Highly efficient modification of beta-lactoglobulin (BLG) gene via zinc-finger nucleases in cattle. In: Cell Research. 2011. doi:10.1038/cr.2011.153.
  30. D. Carroll: Zinc-finger Nucleases as Gene Therapy Agents. In: Gene Therapy. 15, Nr. 22, 2008, S. 1463–1468. doi:10.1038/gt.2008.145. PMID 18784746. PMC 2747807 (freier Volltext).
  31. H. Li, V. Haurigot, Y. Doyon, T. Li, S. Y. Wong, A. S. Bhagwat, N. Malani, X. M. Anguela, R. Sharma, L. Ivanciu, S. L. Murphy, J. D. Finn, F. R. Khazi, S. Zhou, D. E. Paschon, E. J. Rebar, F. D. Bushman, P. D. Gregory, M. C. Holmes, K. A. High: In vivo genome editing restores haemostasis in a mouse model of haemophilia. In: Nature. 475, Nr. 7355, 2011, S. 217–221. doi:10.1038/nature10177. PMID 21706032. PMC 3152293 (freier Volltext).
  32. Pablo Tebas, David Stein, Winson W. Tang, Ian Frank, Shelley Q. Wang, Gary Lee, S. Kaye Spratt, Richard T. Surosky, Martin A. Giedlin, Geoff Nichol, Michael C. Holmes, Philip D. Gregory, Dale G. Ando, Michael Kalos, Ronald G. Collman, Gwendolyn Binder-Scholl, Gabriela Plesa, Wei-Ting Hwang, Bruce L. Levine, Carl H. June: Gene Editing of CCR5 in Autologous CD4 T Cells of Persons Infected with HIV. In: New England Journal of Medicine. 370, Nr. 10, 6. März 2014, S. 901–910. doi:10.1056/NEJMoa1300662. PMID 24597865.
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