Free-Flow-Elektrophorese

Die Free-flow-Elektrophorese (auch trägerfreie Elektrophorese o​der Freifluss-Elektrophorese genannt) i​st eine kontinuierliche (semi)präparative elektrophoretische Trennmethode d​er Biochemie, d​ie insbesondere z​ur Gewinnung gereinigter Proteine, Proteinkomplexe, Peptide, DNA-Origami u​nd Organellen i​n größeren Mengen dient, w​ie sie für präparative Verfahren z​ur Verfügung stehen müssen.

Eigenschaften

Typische Anwendungen für die Free Flow Elektrophorese (FFE) sind die Auftrennung von komplexen Proteingemischen, Isolierung von Proteinisoformen und die Aufreinigung von Partikeln, Organellen oder Zellen zur weiteren Analytik. Ein Vorteil der FFE Methode ist, dass die Trennung sehr schnell und schonend in wässrigem Medium erfolgt und keine Interaktion mit einer festen Matrix, wie zum Beispiel Polyacrylamid bei der Gelelektrophorese, stattfindet. Somit ist die Wiederfindungsrate vergleichsweise hoch, da theoretische keine Analyten verlorengehen. Die FFE Trennungen laufen stets kontinuierlich ab, dadurch ist es möglich, große Mengen der Analyten aufzureinigen. Bei kommerziellen Systemen liegt der Durchsatz zwischen ein bis vier Milligramm der Probe pro Stunde. Des Weiteren können die Trennungen für Proteine sowohl mit Erhaltung der ursprünglichen Konformation als auch denaturierend durchgeführt werden.

Verfahren

Ein gleichmäßiger, laminarer Flüssigkeitsstrom wird durch zwei Platten geleitet, wobei er am Ende der Platten in parallel angeordnete, gleichartige Kapillarröhrchen einfließt und von dort in Auffanggefäße, meist Mikrotiterplatten geleitet wird.

Schematische Funktionsweise der Free Flow Elektrophorese

Quer z​ur Fließrichtung w​ird eine elektrische Spannung a​n die gepufferte Lösung angelegt. Wenn a​n der Probenaufgabestelle e​ine Proteinlösung eingeschleust wird, werden d​ie Proteine während d​es Transports d​urch die Trennkammer gemäß Ladungsdichte o​der dem isoelektrischen Punkt aufgetrennt, s​o dass s​ie in verschiedenen Kapillarröhrchen landen. Bei geeigneter Standardisierung u​nd Kontrolle a​ller Parameter eignet s​ich das Verfahren a​ls kontinuierliche Methode für d​ie Präparation größerer Mengen unterschiedlich geladener Moleküle.

Es lassen s​ich verschiedene elektrophoretische Verfahren i​n der Trennkammer anwenden:

Geschichte

Das Free Flow Elektrophorese Verfahren wurde in den 1960er Jahren maßgeblich von Kurt Hannig am Max-Planck-Institut für Biochemie entwickelt[1]. Es war bis in die 1980er Jahre ein standardisiertes Trennverfahren für Zellen und Organellen. Zudem wurden zahlreiche Free Flow Elektrophoreseversuche im Spacelab durchgeführt, um den Einfluss der Sedimentation im gravitationsfreien Raum zu minimieren.[2] Die Einführung der Durchflusszytometrie beendete teilweise die Anwendung der FFE zur Zelltrennung und die Applikationen der Free Flow Elektrophorese verlagerten sich bis heute weitgehend auf die Trennung von Partikeln, Proteinen und Peptidgemischen.[3] Einige Forschungsgruppen arbeiten auch an miniaturisierten FFE Systemen (µFFE) für verschiedene Einsatzzwecke.[4][5]

Aufbau der Free Flow Elektrophoreseapparatur
Aufbau eines Free Flow Elektrophoreseinstruments

Die Trennkammer besteht je aus einer Rückplatte und einer Frontplatte. Die Rückplatte besteht aus einem kühlbaren Aluminiumblock, der mit einer kunststoffbeschichteten und verspiegelten Glasplatte beschichtet ist. Die Frontplatte besteht üblicherweise aus Acrylglas (PMMA). Der Abstand der Platten beträgt bei kommerziellen Systemen üblicherweise 0,1 – 0,5 mm. In der Frontplatte befinden sich die Einlässe für die Trennmedien, die Probeneinlässe, die Fraktionierschläuche und die Elektroden. Die Trennmedien und Proben werden je über eine Schlauchpumpe in die Trennkammer gefördert. Wichtig hierbei ist, dass eine laminare Strömung vorliegt. Senkrecht zur Flussrichtung wird das elektrische Feld über die Elektroden aufgebaut. Am Ende der Trennkammer wird die getrennte Probe in 96 Fraktionierschläuchen abgegriffen und in die Auffanggefäße geleitet.[6]

Quellen
  1. Free Flow Elektrophoresis, Kurt Hannig und Hans G. Heidrich, GIT Verlag 1990, ISBN 3-921956-88-9
  2. Electrophoresis Operations in Space (PDF; 4,6 MB)
  3. Free-flow electrophoresis in the proteomic era: a technique in flux. Islinger M, Eckerskorn C, Völkl A. Electrophoresis. 2010 Jun;31(11):1754-63. doi:10.1002/elps.200900771. Review. PMID 20506416
  4. S. Jezierski, L. Gitlin, S. Nagl, D. Belder Multistep liquid-phase lithography for fast prototyping of microfluidic free-flow-electrophoresis chips, Anal. Bioanal. Chem., 2011, 401, 2651–2656. PMID 21892629
  5. Miniaturizing free-flow electrophoresis - a critical review. Kohlheyer D, Eijkel JC, van den Berg A, Schasfoort RB. Electrophoresis. 2008 Mar;29(5):977-93. doi:10.1002/elps.200700725. Review. PMID 18232029
  6. Prinzip der FFE Trennungen
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