Expressionsklonierung

Die Expressionsklonierung umfasst in der Genetik Methoden zur Identifikation unbekannter Gene anhand einer Eigenschaft oder Funktion der von ihnen exprimierten Proteine. Mittels Klonierung wird zuerst eine Genbibliothek in Vektoren generiert, die die Expression der DNA erlauben. Dabei codiert jeder Klon für maximal ein Protein. Diese Expressionsbibliothek wird nach einem Merkmal eines bestimmten Proteins, oder einer Gruppe von Proteinen abgesucht. Dieses Herausfiltern oder Suchen wird als Screening bezeichnet. Die so isolierten Klone werden dann weiter charakterisiert.

Prinzip

In den meisten Fällen werden cDNAs untersucht und auf der Basis der Eigenschaften des von ihnen codierten Proteins isoliert. Zu diesem Zweck werden cDNAs von der mRNA des Organismus, des Gewebes, des Zelltyps, bzw. des Entwicklungsstadiums generiert, die die Isolierung der gewünschten cDNA wahrscheinlich machen, und in die Klonierungsstelle eines Expressionsvektors ligiert. So wurde z. B. die erste cDNA eines spannungsgesteuerten Kaliumkanals aus dem elektrischen Organ des Marmor-Zitterrochens isoliert.[1] Viele der heute bekannten cDNAs wurden mittels des Bakteriophagen Lambda gt11-Expressionssystems charakterisiert. Der Bakteriophage Lambda erlaubt eine sehr dichte Ausplattierung auf einem E. coli-Bakterienrasen. Jede Plaque entspricht einem Klon, der nach Induktion ein β-Galactosidase-Fusionsprotein generiert. Der Nachweis der Proteine gelingt nach Übertragung des Phagens auf einen Membranfilter (häufig Nitrocellulose), z. B. mittels eines Antikörpers gegen das zu untersuchende Protein oder, im Falle von Transkriptionsfaktoren, mit einer radioaktiv markierten doppelsträngigen DNA.[2][3]

Eine weitere Methode setzt sogenannte Pools von cDNA-Klonen in Vektoren ein, die eine in vitro-Transkription mit RNA-Polymerasen aus Bakteriophagen, wie der T7-RNA-Polymerase, erlauben.[4] Die RNAs werden nach Injektion in Oocyten des Krallenfrosches Xenopus laevis translatiert.[5] Die Oocyten werden auf Anwesenheit des gesuchten Proteins, z. B. einem Ionenkanal oder einem G-Protein-gekoppelten Rezeptors hin untersucht. Die positiven Pools werden in Subpools aufgetrennt, bis genau eine RNA den gewünschten Effekt hervorruft. Ein Beispiel für diese Strategie ist die Klonierung des ATP-Rezeptors.[6] Auch das Hefe-Zwei-Hybrid-System, das Hefe-Ein-Hybrid-System und das Phagen-Display werden zur Expressionsklonierung genutzt.[7]

Einzelnachweise

T. J. Jentsch, K. Steinmeyer, G. Schwarz: Primary structure of Torpedo marmorata chloride channel isolated by expression cloning in Xenopus oocytes. In: Nature. Band 348, Nummer 6301, Dezember 1990, S. 510–514, doi:10.1038/348510a0, PMID 2174129.
R. A. Young, R. W. Davis: Efficient isolation of genes by using antibody probes. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 80, Nummer 5, März 1983, S. 1194–1198, PMID 6219389, PMC 393560 (freier Volltext).
Y. Ramanathan: Functional Cloning, Sorting, and Expression Profiling of Nucleic Acid-Binding Proteins. In: Genome Research. 12, S. 1175, doi:10.1101/gr.156002.
D. A. Melton, P. A. Krieg, M. R. Rebagliati, T. Maniatis, K. Zinn, M. R. Green: Efficient in vitro synthesis of biologically active RNA and RNA hybridization probes from plasmids containing a bacteriophage SP6 promoter. In: Nucleic acids research. Band 12, Nummer 18, September 1984, S. 7035–7056, PMID 6091052, PMC 320141 (freier Volltext).
C. Z. Plautz, H. C. Williams, R. M. Grainger: Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System. In: Journal of visualized experiments : JoVE. Nummer 107, Januar 2016, S. e53518, doi:10.3791/53518, PMID 26862700.
K. D. Lustig, A. K. Shiau, A. J. Brake, D. Julius: Expression cloning of an ATP receptor from mouse neuroblastoma cells. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 90, Nummer 11, Juni 1993, S. 5113–5117, PMID 7685114, PMC 46665 (freier Volltext).
J. L. Jestin: Functional cloning by phage display. In: Biochimie. Band 90, Nummer 9, September 2008, S. 1273–1278, doi:10.1016/j.biochi.2008.04.003, PMID 18466773 (Review).

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[PMID2174129-1] T. J. Jentsch, K. Steinmeyer, G. Schwarz: Primary structure of Torpedo marmorata chloride channel isolated by expression cloning in Xenopus oocytes. In: Nature. Band 348, Nummer 6301, Dezember 1990, S. 510–514, doi:10.1038/348510a0, PMID 2174129.

[PMID6219389-2] R. A. Young, R. W. Davis: Efficient isolation of genes by using antibody probes. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 80, Nummer 5, März 1983, S. 1194–1198, PMID 6219389, PMC 393560 (freier Volltext).

[DOI10.1101/gr.156002-3] Y. Ramanathan: Functional Cloning, Sorting, and Expression Profiling of Nucleic Acid-Binding Proteins. In: Genome Research. 12, S. 1175, doi:10.1101/gr.156002.

[PMID6091052-4] D. A. Melton, P. A. Krieg, M. R. Rebagliati, T. Maniatis, K. Zinn, M. R. Green: Efficient in vitro synthesis of biologically active RNA and RNA hybridization probes from plasmids containing a bacteriophage SP6 promoter. In: Nucleic acids research. Band 12, Nummer 18, September 1984, S. 7035–7056, PMID 6091052, PMC 320141 (freier Volltext).

[PMID26862700-5] C. Z. Plautz, H. C. Williams, R. M. Grainger: Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System. In: Journal of visualized experiments : JoVE. Nummer 107, Januar 2016, S. e53518, doi:10.3791/53518, PMID 26862700.

[PMID7685114-6] K. D. Lustig, A. K. Shiau, A. J. Brake, D. Julius: Expression cloning of an ATP receptor from mouse neuroblastoma cells. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 90, Nummer 11, Juni 1993, S. 5113–5117, PMID 7685114, PMC 46665 (freier Volltext).

[PMID18466773-7] J. L. Jestin: Functional cloning by phage display. In: Biochimie. Band 90, Nummer 9, September 2008, S. 1273–1278, doi:10.1016/j.biochi.2008.04.003, PMID 18466773 (Review).