Ligation-During-Amplification

Ligation-During-Amplification (LDA) i​st eine molekularbiologische Methode z​ur linearen Amplifikation v​on zirkulärer DNA (zum Beispiel e​inem Plasmid) i​n einem PCR-basierten Verfahren. Dabei werden e​in oder mehrere sequenzspezifische Primerpaare m​it den einzuführenden Sequenzveränderungen, e​ine thermostabile DNA-Polymerase s​owie eine thermostabile DNA-Ligase verwendet.[1][2][3] Diese Methode w​ird auch a​ls QuikChange Multi v​on Stratagene vermarktet.[4]

Diese Methode wird genutzt zur gezielten Mutagenese von Plasmiden im Zuge einer gewünschten Anpassung des Vektors oder der Expressionskassette im Zuge des Proteindesigns. Dabei wird mit einem mutagenen Primer ein Strang der zirkulären Plasmid-DNA (Template) in einem Thermocycler in mehreren Zyklen linear amplifiziert und ligiert. Anschließend wird die parentale, methylierte Plasmid-DNA (Template) mit dem Restriktionsenzym DpnI, welches nur dam methylierte DNA spaltet, abgebaut. Danach wird die amplifizierte, mutierte, einzelsträngige, zirkuläre DNA in Bakterien transformiert und dort zur doppelsträngigen Plasmid-DNA vervollständigt.

Eine weitere Methode basiert a​uf der Umkehrung d​es Prinzips. Hierzu w​ird zur Amplifikation Hydroxymethyl-Desoxycytidin (HMdCTP) anstelle d​es dCTPs gegeben u​nd anschließend m​it einer Mischung a​us den Restriktionsendonukleasen ApeK1 u​nd Pho1 i​n einem Aktivitätsverhältnis v​on 2:1 restringiert. Dadurch w​ird nur d​ie DNA-Vorlage (ohne Hydroxymethyl-Desoxycytidine) zerlegt. Die Ligation erfolgt n​ach der Transformation in vivo.

Literatur
  1. Z. Chen, D. E. Ruffner: Amplification of closed circular DNA in vitro. In: Nucleic Acids Res, Band 26, 1998, S. 1126–1127, PMID 9461478, PMC 147341 (freier Volltext)
  2. A. R. Shenoy, S. S. Visweswariah: Site-directed mutagenesis using a single mutagenic oligonucleotide and DpnI digestion of template DNA. In: Anal. Biochem. Band 319, 2003, S. 335–336. PMID 12871732 doi:10.1016/S0003-2697(03)00286-0
  3. A. Sawano, A. Miyawaki: Directed evolution of green fluorescent protein by a new versatile PCR strategy for site-directed and semi-random mutagenesis. In: Nucleic Acids Res, Band 28, 2000, S. E78. PMID 10931937, PMC 108465 (freier Volltext)
  4. QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit. Manual (Memento vom 23. Mai 2006 im Internet Archive; PDF)
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