Digital Polymerase Chain Reaction

Die Digital Polymerase Chain Reaction (zu deutsch ‚Digitale Polymerase-Kettenreaktion‘, auch dPCR, digital PCR, Digital-PCR) ist eine biochemische Methode zur Mengenbestimmung einzelner DNA-Sequenzen.[1] Sie ist eine Variante der Polymerase-Kettenreaktion.

Prinzip

Die dPCR verwendet im Gegensatz zur PCR eine Vereinzelung der DNA-Moleküle durch Grenzverdünnung und Mikrofluidik in einer großen Anzahl getrennter Reaktionsgefäße mit einem Volumen im Femtoliterbereich (z. B. 36 fL).[2][3] Dadurch werden im Unterschied zur Mengenbestimmung per qPCR Varianzen der Amplifikationseffizienz vermieden, bei geringerer Empfindlichkeit gegenüber PCR-Inhibitoren, aber höherer Nachweisgrenze.[4] Die Verteilung der DNA-Moleküle folgt der Poisson-Verteilung.

Die Amplifikation mit der DNA-Polymerase erfolgt mit den vereinzelten DNA-Molekülen. Daher kommt es in jedem Reaktionsgefäß zu einem digitalen Ergebnis (Amplifikation: ja oder nein), woher die Bezeichnung stammt. Durch Auszählen einer großen Anzahl von Reaktionsgefäßen (High-throughput screening mit circa 20.000 Reaktionsgefäßen auf einem Quadratmillimeter)[2] wird eine statistische Signifikanz erreicht. Der Anteil an Reaktionsgefäßen mit erfolgter Amplifikation ist proportional zur eingesetzten DNA-Menge der amplifizierten DNA-Sequenz, was zur Mengenbestimmung verwendet wird. Die dPCR kann auch mit Varianten der isothermalen DNA-Amplifikation kombiniert werden.[4]

Anwendungen

Die dPCR wird unter anderem zur Diagnostik von Pathogenen,[5] zur Bestimmung selten vorkommender DNA-Sequenzen und Gene copy number variants,[6] selten vorkommender Mutationen[7] (Primer-bindende Varianten unter 1 %)[8] und zu Mengenvergleichen bei der Genexpression verwendet.[9]

Geschichte

Die dPCR wurde 1992 von Alec A. Morley und Pamela J. Sykes entwickelt.[1]

Literatur

B. K. Jacobs, E. Goetghebeur, L. Clement: Impact of variance components on reliability of absolute quantification using digital PCR. In: BMC Bioinformatics. Band 15, 2014, S. 283, doi:10.1186/1471-2105-15-283, PMID 25147026.

Einzelnachweise

P. J. Sykes, S. H. Neoh, M. J. Brisco, E. Hughes, J. Condon, A. A. Morley: Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. In: BioTechniques. Band 13, Nummer 3, September 1992, S. 444–449, PMID 1389177.
Y. Men, Y. Fu, Z. Chen, P. A. Sims, W. J. Greenleaf, Y. Huang: Digital polymerase chain reaction in an array of femtoliter polydimethylsiloxane microreactors. In: Analytical chemistry. Band 84, Nummer 10, Mai 2012, S. 4262–4266, doi:10.1021/ac300761n, PMID 22482776.
B. Vogelstein, K. W. Kinzler: Digital PCR. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 96, Nummer 16, August 1999, S. 9236–9241, PMID 10430926, PMC 17763 (freier Volltext).
G. Nixon, J. A. Garson, P. Grant, E. Nastouli, C. A. Foy, J. F. Huggett: Comparative study of sensitivity, linearity, and resistance to inhibition of digital and nondigital polymerase chain reaction and loop mediated isothermal amplification assays for quantification of human cytomegalovirus. In: Analytical chemistry. Band 86, Nummer 9, Mai 2014, S. 4387–4394, doi:10.1021/ac500208w, PMID 24684191.
R. H. Sedlak, K. R. Jerome: Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. In: Diagnostic microbiology and infectious disease. Band 75, Nummer 1, Januar 2013, S. 1–4, doi:10.1016/j.diagmicrobio.2012.10.009, PMID 23182074, PMC 3519953 (freier Volltext).
L. B. Pinheiro, V. A. Coleman, C. M. Hindson, J. Herrmann, B. J. Hindson, S. Bhat, K. R. Emslie: Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. In: Analytical chemistry. Band 84, Nummer 2, Januar 2012, S. 1003–1011, doi:10.1021/ac202578x, PMID 22122760, PMC 3260738 (freier Volltext).
D. Pekin, Y. Skhiri, J. C. Baret, D. Le Corre, L. Mazutis, C. B. Salem, F. Millot, A. El Harrak, J. B. Hutchison, J. W. Larson, D. R. Link, P. Laurent-Puig, A. D. Griffiths, V. Taly: Quantitative and sensitive detection of rare mutations using droplet-based microfluidics. In: Lab on a Chip. Band 11, Nummer 13, Juli 2011, S. 2156–2166, doi:10.1039/c1lc20128j, PMID 21594292.
L. Miotke, B. T. Lau, R. T. Rumma, H. P. Ji: High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR. In: Analytical chemistry. Band 86, Nummer 5, März 2014, S. 2618–2624, doi:10.1021/ac403843j, PMID 24483992, PMC 3982983 (freier Volltext).
P. Manoj: Droplet digital PCR technology promises new applications and research areas. In: Mitochondrial DNA. [elektronische Veröffentlichung vor dem Druck] April 2014, doi:10.3109/19401736.2014.913168, PMID 24779593.

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[PMID_1389177-1] P. J. Sykes, S. H. Neoh, M. J. Brisco, E. Hughes, J. Condon, A. A. Morley: Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. In: BioTechniques. Band 13, Nummer 3, September 1992, S. 444–449, PMID 1389177.

[PMID_22482776-2] Y. Men, Y. Fu, Z. Chen, P. A. Sims, W. J. Greenleaf, Y. Huang: Digital polymerase chain reaction in an array of femtoliter polydimethylsiloxane microreactors. In: Analytical chemistry. Band 84, Nummer 10, Mai 2012, S. 4262–4266, doi:10.1021/ac300761n, PMID 22482776.

[3] B. Vogelstein, K. W. Kinzler: Digital PCR. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 96, Nummer 16, August 1999, S. 9236–9241, PMID 10430926, PMC 17763 (freier Volltext).

[PMID_24684191-4] G. Nixon, J. A. Garson, P. Grant, E. Nastouli, C. A. Foy, J. F. Huggett: Comparative study of sensitivity, linearity, and resistance to inhibition of digital and nondigital polymerase chain reaction and loop mediated isothermal amplification assays for quantification of human cytomegalovirus. In: Analytical chemistry. Band 86, Nummer 9, Mai 2014, S. 4387–4394, doi:10.1021/ac500208w, PMID 24684191.

[5] R. H. Sedlak, K. R. Jerome: Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. In: Diagnostic microbiology and infectious disease. Band 75, Nummer 1, Januar 2013, S. 1–4, doi:10.1016/j.diagmicrobio.2012.10.009, PMID 23182074, PMC 3519953 (freier Volltext).

[6] L. B. Pinheiro, V. A. Coleman, C. M. Hindson, J. Herrmann, B. J. Hindson, S. Bhat, K. R. Emslie: Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. In: Analytical chemistry. Band 84, Nummer 2, Januar 2012, S. 1003–1011, doi:10.1021/ac202578x, PMID 22122760, PMC 3260738 (freier Volltext).

[7] D. Pekin, Y. Skhiri, J. C. Baret, D. Le Corre, L. Mazutis, C. B. Salem, F. Millot, A. El Harrak, J. B. Hutchison, J. W. Larson, D. R. Link, P. Laurent-Puig, A. D. Griffiths, V. Taly: Quantitative and sensitive detection of rare mutations using droplet-based microfluidics. In: Lab on a Chip. Band 11, Nummer 13, Juli 2011, S. 2156–2166, doi:10.1039/c1lc20128j, PMID 21594292.

[8] L. Miotke, B. T. Lau, R. T. Rumma, H. P. Ji: High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR. In: Analytical chemistry. Band 86, Nummer 5, März 2014, S. 2618–2624, doi:10.1021/ac403843j, PMID 24483992, PMC 3982983 (freier Volltext).

[9] P. Manoj: Droplet digital PCR technology promises new applications and research areas. In: Mitochondrial DNA. [elektronische Veröffentlichung vor dem Druck] April 2014, doi:10.3109/19401736.2014.913168, PMID 24779593.