Bradford-Test
Der Bradford-Test ist eine photometrische Methode zur quantitativen Bestimmung von Proteinen bis zu Konzentrationen im Bereich Mikrogramm pro Milliliter.[1] Er ist nach dem US-amerikanischen Biochemiker Marion M. Bradford benannt.
Prinzip
Der Triphenylmethanfarbstoff Coomassie-Brillant-Blau G-250 (CBBG) bildet in saurer Lösung mit kationischen und unpolaren Seitenketten von Proteinen Komplexe. Die ungebundene (kationische), rote Form des Farbstoffs hat im Absorptionsspektrum ein Maximum bei 470 nm. Durch die Komplexbildung mit Proteinen wird der Farbstoff in seiner blauen, unprotonierten, anionischen Sulfonatform stabilisiert und das Absorptionsmaximum verschiebt sich auf 595 nm.[2] Da der Extinktionskoeffizient des Farbstoff-Protein-Komplexes außerdem sehr viel höher als der des freien Farbstoffes ist, kann die Zunahme der Absorption bei 595 nm durch die Bildung des Komplexes mit hoher Empfindlichkeit gegen das freie Farbreagenz photometrisch gemessen werden und ist ein Maß für die Proteinkonzentration der Lösung.
Das Maß der Farbreaktion ist vom Protein abhängig; deshalb wird zur Konzentrationsbestimmung eines bestimmten Proteins eine Kalibrierung notwendig. Steht diese nicht zur Verfügung oder soll die Konzentration eines Proteingemischs bestimmt werden, werden Standardproteine zur Kalibrierung genutzt (z. B. Chymotrypsin, Lysozym oder BSA). Dabei können je nach Zusammensetzung des Proteingemisches für gleiche Proteinmengen unterschiedliche Ergebnisse erhalten werden. Somit ist die Bradfordbestimmung hier ungenau. Ihre Vorteile sind ihre hohe Sensitivität und die einfache und schnelle Durchführung.
Bestimmungsgrenze
Die Bestimmungsgrenze des Mikrotests beträgt 1–20 µg/ml, des Makrotests 20–200 µg/ml Protein.
Störende Substanzen
Der Bradford-Test wird bereits durch geringe Konzentrationen von Detergenzien wie z. B. SDS gestört. Diese binden ebenfalls an das Protein und konkurrieren mit dem Farbstoff um Bindungsstellen bzw. verdrängen ihn vom Protein, wodurch die Farbreaktion verhindert wird. Hingegen haben chaotrope Verbindungen wie z. B. Guanidiniumchlorid, Reduktionsmittel wie DTT (Dithiothreitol) oder Chelatoren keinen Einfluss auf das Ergebnis.[3] Wenn Detergenzien nicht aus den Proteinproben eliminiert werden können muss ein anderer Nachweis wie z. B. der BCA-Test – welcher gegenüber Detergenzien unempfindlich ist und wie auch der Lowry-Test eine kleinere Nachweisgrenze aufweist – verwendet werden.
Vorteile
- Schnell und preiswert
- Sehr sensitiv
- Farbstoff-Protein-Komplex ist für knapp eine Stunde stabil
Nachteile
- Kalibrierung nötig
- Störanfällig gegenüber proteinchemischen Reagenzien
- Nichtlineare Standardkurve über einen großen Bereich
- Die Empfindlichkeit für verschiedene Proteine kann weit streuen, womit die Wahl des Standards wichtig wird. Die Methode ist für eine genaue Quantifizierung nur eingeschränkt brauchbar.
Einzelnachweise
- Bradford, M.M. (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. In: Anal. Biochem. Bd. 72, S. 248–254. PMID 942051 doi:10.1016/0003-2697(76)90527-3 PDF.
- Compton, S. J., Jones, C. G.: Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. In: Anal. Biochem. Bd. 151 (1985), S. 369–374. PMID 4096375 doi:10.1016/0003-2697(85)90190-3.
- Bio-Rad Laboratories: Quick Start Bradford Assay Instruction Manual. S. 7.
Siehe auch
Weblinks
- Serva: Bradford (PDF, deutsch; 125 kB)