Supercritical Angle Fluorescence

Supercritical Angle Fluorescence (SAF) (dt.: Fluoreszenz oberhalb d​es kritischen Winkels) i​st eine Methode d​er Mikroskopie z​ur fluoreszenzspektroskopischen Untersuchung biochemischer Spezies u​nd Strukturen (Proteine, DNA, Zellen, Gewebe). Die getrennte Erfassung d​er oberhalb d​es kritischen Winkels abgestrahlten Fluoreszenz ermöglicht d​ie spezifische Untersuchung d​es Kontaktbereichs d​er Probe m​it dem Tragglas (Objektträger, Deckglas).

SAF-Detektion
SAF Emission an der Wasser/Glas Grenzfläche

Das Abstrahlungsverhalten fluoreszierender Moleküle wird bei großer Nähe zu Grenzflächen zwischen dielektrischen Lichtwellenleitern verschiedener Brechungsindizes stark beeinflusst.[1][2] Bei der Mikroskopie an biologischen Proben befindet sich der fluoreszierende Analyt zumeist in einem wässrigen Medium (Brechungsindex ) auf einem Deckglas (). Der kritische Winkel der Wasser/Glas Grenzfläche beträgt ca. 61°. Fluoreszenzfarbstoffe mit einem Abstand zur Glasoberfläche von mehr als einer Wellenlänge emittieren kein Licht oberhalb von ins Glas. Bei kleineren Abständen, besonders im Bereich bis 300 nm, kommt es zur Entstehung von SAF, d. h. zur Fluoreszenzemission oberhalb des kritischen Winkels. Somit führt die getrennte Sammlung von SAF zu einer hohen Spezifität des Detektionsvolumens für die Grenzfläche.[3]

Die u​nter großen Winkeln auftretende SAF-Emission übersteigt d​as Fassungsvermögen herkömmlicher a​uf Lichtbrechung basierter Linsensysteme. Die vollständige Erfassung d​er SAF-Emission w​ird mit e​inem Lichtwellenleiter d​er die SAF-Emission d​urch Totalreflexion a​n seiner parabolischen Mantelfläche z​u einem parallelen Strahlenbündel kollimiert.[4] Diese i​n der Forschungsgruppe v​on Stefan Seeger entwickelte Detektionstechnik bildet d​ie Grundlage d​er SAF-Mikroskopie, a​ber auch d​ie von Biosensoren u​nd Nachweissystemen für d​ie medizinische Diagnostik.[5][6]

SAF-Mikroskop

Für die SAF-Mikroskopie wird ein spezielles Mikroskopobjektiv verwendet, das einen parabolischen Lichtleiter sowie ein Linsensystem hoher numerischer Apertur beinhaltet. Das innere Linsensystem dient der Anregung der Probe und der Sammlung unterhalb des kritischen Winkels abgestrahlter Fluoreszenz, der äußere parabolische Lichtleiter zur Sammlung von SAF. Die getrennte, simultane Messung der oberhalb und unterhalb von abgestrahlten Fluoreszenz ermöglicht die parallele Mikroskopie mit zwei verschiedenen Auflösungen entlang der optischen Achse.[7][8]

Einzelnachweise
  1. W. Lukosz, R. Kunz: Light emission by magnetic and electric dipoles close to a plane interface. I. Total radiated power. J. Opt. Soc. Am. 67, 1607–1614 (1977).
  2. W. Lukosz, R. Kunz: Light emission by magnetic and electric dipoles close to a plane interface. II. Radiation patterns of perpendicular oriented dipoles. J. Opt. Soc. Am. 67, 1615–1619 (1977).
  3. J. Enderlein, T. Ruckstuhl, S. Seeger: Highly efficient optical detection of surface-generated fluorescence. Appl. Opt. 38, 724–732 (1999).
  4. T. Ruckstuhl, S. Seeger: Light detecting optical device, US6714297, EP1076823, WO9946596 (1998).
  5. T. Ruckstuhl, M. Rankl, S. Seeger: Highly efficient biosensing using a supercritical angle fluorescence (SAF) instrument, In: Biosens Bioelectron. 18, 1193–1199 (2003).
  6. A. Krieg, S. Laib, T. Ruckstuhl, M. Rankl, S. Seeger: Fast detection of single nucleotide polymorphisms (SNPs) by primer elongation with monitoring of supercritical-angle fluorescence, In: ChemBioChem 5, 1680–1685 (2004).
  7. T. Ruckstuhl, D. Verdes: Supercritical angle fluorescence (SAF) microscopy, Opt. Express 12, 4246–4254 (2004).
  8. D. Verdes, T. Ruckstuhl, S. Seeger: Parallel two-channel near- and far-field fluorescence microscopy J. Biomed. Opt. 12, 34012 (2007).
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